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    RIP技术(RNA结合蛋白免疫沉淀)

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    产品产地: 中国大陆
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    RIP技术(RNA结合蛋白免疫沉淀),RIP技术(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀),是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析;
     

    RIP技术(RNA结合蛋白免疫沉淀)

    RIP技术(RNA Binding Protein ImmunoprecipitationRNA结合蛋白免疫沉淀)是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。分析与目的蛋白结合的RNA.运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析;即用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白,防止非特异性的RNA的结合,免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来,结合的RNA序列可通过microarrayRIP-Chip),定量RT-PCR 高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,能帮助我们发现miRNA的调节靶点。

     

    RIP实验流程
    (一). 细胞裂解液获取
    A. 单层细胞或者贴壁细胞处理
    1. PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次
    2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,收集至enpendoff
    3. 1500rpm4离心5min,弃上清,收集细胞
    4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于冰上静置5min
    5. 每管分装200ul细胞裂解液,贮存于-80
    B. 悬浮细胞处理:先收集细胞再计数,然后清洗裂解
    C. 组织样品处理
    1.PBS清洗新鲜切下的组织三次
    2. 加入冷PBS后,用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞,计数
    3. 1500rpm4离心5min,弃上清,收集细胞
    4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后置于冰上静置5min
    5. 每管分装200ul细胞裂解液,贮存于-80
    (二). 磁珠的准备
    A. 实验前准备
    1enpendoff
    2、磁力架
    3、冰盒, RIP Wash Buffer置于冰上
    4、抗体,置于冰上
    5、涡旋震荡器
    6、枪、枪头放于超净台照射30min,枪喷DEPC
    B. 磁珠准备过程
    1. 重悬磁珠
    2. 标记实验所需的enpendoff管,样品包括目的样品,阴性对照与阳性对照
    3. 吸取50ul 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff
    4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡
    5.enpendoff管置于磁力架上,并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线,去上清,重复一次
    6.100ulRIP Wash Buffer重悬磁珠,加入约5ug相应抗体于每个样品中
    7. 室温孵育30min
    8. enpendoff管置于磁力架上,弃上清
    9. 加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡后弃上清,重复一次
    10. 加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡后置于冰上
    (三). RNA结合蛋白免疫沉淀
    A. 准备工作
    1、冰盒
    2360°旋转仪
    3RIP Wash Buffer 0.5M EDTA RNase Inhibitor 置于冰上
    B. RNA结合蛋白免疫沉淀实验过程
    1.准备RIP Immunoprecipitation Buffer
    2.将前上步的enpendoff管放磁力架上,去上清,每管加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
    3. 迅速解冻*步制备的细胞裂解液,14,000rpm4离心10min。吸取100ul上清液于上一步的磁珠-抗体复合物中,使得总体积为1ml
    4. 4孵育3h至过夜
    5. 短暂离心,将enpendoff管放在磁力架上,弃上清
    6. 加入500ul RIP Wash Buffer,涡旋震荡后将enpendoff管放在磁力架上,弃上清,重复清洗6
    (四). RNA纯化
    A. 实验前准备
    1.枪、枪头、enpendoff管紫外照射30min,喷DEPC水以除RNA
    2. Salt SolutionSalt SolutionRIP Wash BufferProteinase K10%SDSPrecipitate Enhancer 置于冰上
    3.RNase-free的乙醇、lv仿、异戊醇
    4.DEPC水置于冰上
    5. 离心机预冷
    6. 冰盒
    B. RNA纯化过程
    1.准备Proteinase K Buffer。每个样品需150ul
    2.150ul Proteinase K Buffer重悬上述磁珠-抗体复合物
    3. 55孵育30min
    4. 孵育完之后,将enpendoff管置于磁力架上,将上清液吸入一新的enpendoff管中
    5. 于每管上清液中加入250ulRIP Wash Buffer
    6. 于每管加入400ul苯酚:lv仿:异戊醇,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min
    7. 小心的吸取350ul上层水相,吸入另一新的enpendoff
    8. 于每管加入400ul lv仿,涡旋震荡15s,室温下14,000rpm离心10min
    9. 小心的吸取300ul上层水相,吸入另一新的enpendoff
    10. 每管加入50ul Salt Solution15ul Salt Solution,5ul Precipitate Enhancer 850ul 无水乙醇(RNase),混合,-80保持1h至过夜
    11. 14,000rpm4离心30min,小心去上清
    12. 80%乙醇冲洗一次,14,000rpm4离心15min,小心去上清,空气中晾干.
    13. 10-20ul DEPC水溶解,-80保存,送测序或进行下游实验。

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